Сухі поживні середовища високо гігроскопічні, їх потрібно зберігати в прохолодному сухому місці, далеко від яскравого світла. Ці середовища призначені тільки для використання в лабораторіі. Уважно прочитайте інструкцію на етикетці. Зверніть особливу увагу на склад середовища, вказівки по її приготування та використання. Зверніть також увагу на термін придатності і номер партії. Перед використанням переконайтеся, що середовище не змінило своїх фізичних властивостей, а термін зберігання не закінчився.

Живильні середовища мають тенденцію до утворення грудок (злежування) в наступних умовах:

• При підвищеній вологості під час зберігання;
• Якщо контейнер тривалий час відкрито;
• Якщо контейнер постійно нещільно закривають;
• Якщо середовище дуже старе.

Для приготування середовища використовуйте чисту, неушкоджену склянну посуду і дистильовану або деіонізовану воду, що відповідає вимогам Фармакопеї США та Міжнародної фармакопеї для чистої води. Помістіть навіску середовища в чисту, суху колбу, обсяг якої в 2-3 рази перевищує кінцевий об’єм готового середовища. Додайте частину приготованої  кількості води і перемішуйте обертальними рухами до розчинення.
Потім потроху, по стінці колби, додавайте залишкову кількість води. Більшість бульйонів на цій стадії повністю розчиняються і виглядають прозорими. Для повного розчинення використовуйте відкритий вогонь, гарячу плиту або киплячу воду, уникаючи надмірного нагріву і підгоряння середовища.

Зазвичай сухі середовища, відновлені з використанням дистильованої або деіонізірованної води, при 25°С мають ті значення рН, які вказані на етикетці. Проте рекомендується, особливо при використанні  давно зберігаючихся середовищ, перевіряти і при необхідності коректувати значення рН.
Вимірювання рН у рідких середовищах слід проводити при 25°С, а у розплавлених щільних – при 40-45°С. Значення рН доводять до необхідного, шляхом додавання 1 N або 0,1 N розчинів соляної кислоти або гідроксиду натрію до певного об’єму зразка (наприклад, до 50 або 100 мл середовища). Після перерахунку до залишку об’єму середовища додають необхідну кількість кислоти чи луги.
Стерилізація

Повністю приготовлену середу стерилізують, як зазначено на етикетці.
Зазвичай стерилізацію проводять в автоклаві, 15 хвилин при 121 ° С. Співвідношення температур і тисків наведено в Таблиці 1.

Таблиця 1. Співвідношення температур і тисків

Час від часу необхідно перевіряти ефективність автоклавування. Температурні умови в різних точках робочої камери автоклава неоднакові. Їх можна перевірити за допомогою двох флаконів з 2% -м розчином глюкози в 2% -му розчині гидрофосфату натрію, які поміщають в різні місця робочої камери. Нагрівання надає розчину коричневий колір. Вміст флакона, розташованого біля отвору для надходження пара, має більш інтенсивне коричневе забарвлення, ніж у вмісті інших флаконів.
При стерилізації наполегливо рекомендується точно слідувати вказівкам на етикетці
Перед введенням термолабільних добавок в простерилізоване середовище їх необхідно остудити. Добавки асептично вводять в рідке середовище, охолоджене до кімнатної температури, або в живильний агар, охолоджений до 50-55 ° С, як зазначено на етикетці.

Всі автоклави необхідно регулярно перевіряти на ефективність і дієвість.
Фізичними параметрами контролю є температура і тиск пари. Треба перевіряти також насиченість пари і безпеку роботи клапанів. У Росії і деяких інших країнах в програму контролю роботи автоклава включають біологічні тести, що демонструють ефект стерилізації.
Фізико-хімічні тести показують, досягалась чи задана температура при стерелізації , а деякі з них показують і достатність експозиції при даній температурі.

Високі температури і тривале нагрівання є звичайною причиною зсуву рН, потемніння поживних середовищ, випадання преципітату, поганого гелеобразования і втрати якості поживного середовища в цілому. Передбачається, що всі стерилізуємі середовища знаходяться в вигляді розчину, в іншому випадку можливе потемніння середовища (реакція Мейларда).

1. Щоб уникнути появи рясного конденсату на кришках чашок стерильні агарові середовища перед розливом повинні мати температуру 45-50°С. Середовище потрібно  ретельно перемішати, не допускаючи утворення бульбашок повітря, асептически розлити в чашки Петрі. Перед посівом поверхню агарових середовищ повинна бути підсушити в асептичних умовах при 30-40 ° С в термостаті. 
2. Додавання крові: для приготування кров’яного агару краще використовувати дефібриновану кров, ніж кров з антикоагулянтами. Краще використовувати якомога більше свіжу кров, а якщо вона знаходилася на зберіганні (при + 2 … 8 °С, без заморожування), то її попередньо підігрівають до 35-37 ° С в термостаті, а потім додають в розплавлену агарову основу при температурі 45 -50 °С.

Якщо середовище не використане в день приготування, його для запобігання висихання, необхідно зберігати в щільно закритому контейнері. Важливо відзначити, що для уникнення втрати стабільності готових рідких середовищ, його не слід зберігати протягом тривалого часу. Агарові середовища, також щоб уникнути псування, не повинні піддаватися тривалому впливу високих температур (40-50 ° С).

При роботі слід віддавати перевагу свіжоприготовленим середовищам. Живильні середовища з такими лабільними речовинами, як бета-лактамні антибіотики, щоб уникнути втрати активності останніх, треба використовувати протягом декількох днів після приготування.

Чашки з агарового середовища слід зберігати при + 2 … 8°С в щільно закритих контейнерах для запобігання влаговтраті. Рідкі середовища в пробірках і флаконах також бажано закривати герметично. Випаровування вологи може привести до кристалізації деяких компонентів середовища.

Стабільність приготованих середовищ обмежена і значно варіює. Якщо немає спеціальних вказівок, то середовища можна зберігати при 12 … 15°С протягом декількох місяців. Не рекомендується зберігати середовища при негативних температурах, так як при цьому порушується структура гелю.
Перед посівом чашки ретельно перевіряють на відсутність контамінації, нерівностей агаровой поверхні, бульбашок, змін кольору, гемолізу і розривів, викликаних з всиханням середовища. Пробірки та чашки з такими дефектами викидають.

1.  Умови лабораторії: мікробіологічна лабораторія представляє небезпеку для непосвячених і ненавчених осіб, тому ступінь ризику зменшується для тих, хто знає про можливі небезпеки і принципах безпечної поведінки в лабораторії. Завжди слід враховувати умови, в яких проводяться маніпуляції з мікробними культурами. У більшості країн прийняті стандарти для таких умов, в залежності від типу використовуваних мікроорганізмів і категорії мікробіологічної лабораторії. Для роботи з найбільш небезпечними мікроорганізмами пропонується виконання повного комплексу заходів безпеки. Нехтування цими інструкціями та правилами може розглядатися як правопорушення.
2. Дії персоналу: до роботи з інфікованим матеріалом і засіяними живильними середовищами допускається тільки кваліфікований персонал, навчений поводженню з мікробіологічними матеріалами. З усіма зразками досліджуваного матеріалу і мікробними культурами треба звертатися належним чином і допускати їх скидання без знищення в автоклаві. Користувач повинен переконатися у відсутності мікробної контамінації обладнання та апаратури, а при підозрі на неї – застосовувати дезінфікуючі засоби або автоклавування. Непотрібні мікробні культури в скляному посуді (флаконах, пробірках, чашках Петрі) в першу чергу повинні знищуватися автоклавуванням (приблизно 30 хв при 121 ° С).
3. Біологічна безпека: необхідно розуміти, що посів мікроорганізмів на поживні середовища призводить до різкого зростання їх чисельності. У таких високих концентраціях будь який мікроорганізм потенційно небезпечний, тому для запобігання заражень мікробні культури необхідно утилізувати відповідними безпечними методами.

Всі сухі поживні середовища поставляються в вигляді тонкого порошку. Дані продукти призначені для бактеріологічної роботи в лабораторії, як зазначено на відповідних етикетках, і не повинні прямо чи непрямо використовуватись  людьми чи тваринами. Більшість продуктів є дрібнодисперсні летючі порошки, тому слід уникати їх вдихання, щоб не викликати подразнення верхніх дихальних шляхів. Не допускайте тривалого контакту порошку з пошкодженої шкірою або надлишкового цвітіння порошку. Будь-які залишки порошку слід змивати великою кількістю холодної води.

Для попередження попадання аерозолів порошку поживних середовищ в дихальні шляхи рекомендується використовувати індивідуальні захисні маски.
Кожне живильне середовище супроводжується спеціальною інструкцією з приготування і застосування.

Символи небезпеки

Більшість поживних середовищ можуть містити в якості компонентів токсичні речовини, тому з ними треба поводитись так, як зазначено в розділі “Заходи безпеки” інструкції. Якщо в матеріалі є які-небуть токсичні субстанції, на етикетці є відповідні позначення і фрази.

Натрію азид: Зазвичай при використанні в складі будь-якого середовища його концентрація не перевищує 1%, що відповідає низькій токсичності. Тим не менш, деякі особи виявляють підвищену чутливість до цієї речовини, тому треба вживати заходів щодо запобігання вдихання, або потрапляння порошку азида натрію всередину. Ця речовина має властивість реагувати з багатьма металами, особливо, міддю і свинцем, з утворенням вибухових з’єднань – азидів металів. У зв’язку з цим рекомендується строго дотримуватися положень місцевих або національних законодавчих актів по утилізації азиду натрію. Для запобігання тривалого контакту з металевими водостоками і каналізаційними трубами слід змивати залишки цього порошку великою кількістю води. Ці ж заходи необхідні при використанні будь-якої біологічної рідини, що містить азид натрію в якості консерванту.

Літія хлорид: Ця сіль є небезпечною речовиною, тому треба уникати контакту з нею будь-якої ділянки тіла або вдихання парів. При попаданні на шкіру хлориду літію її треба промити великою кількістю води.

Циклогексимід: Це високо токсична сполука, тому слід уникати його попадання на шкіру, утворення аерозолів і вдихання їх.

Фуксин основний : Є потенційним канцерогеном, тому потрібна обережність, щоб не допустити вдихання його порошку або контакту з шкірою.

Натрію гідроселеніт: Це високо токсична сполука з тератогенними і корозійними властивостями, тому при поводженні з ним потрібна особлива обережність. При попаданні на шкіру гідроселеніта натрію її треба промити великою кількістю води.

Перша допомога

При нещасних випадках, пов’язаних з необережним поводженням з небезпечними чи токсичними речовинами, рекомендуються наступні заходи першої допомоги постраждалим.

Вдихання: Вивести потерпілого із зони впливу речовини, зігріти і при необхідності звернутися за медичною допомогою.

Контакт зі шкірою: Негайно видалити всю забруднену речовиною одяг і ретельно промити водою з милом забруднену ділянку шкіри. При наявності симптомів отруєння після закінчення зазначених процедур звернутися за медичною допомогою.

Попадання в середину: Ретельно промити рот великою кількістю води. Негайно дати випити потерпілому 2-3 склянки води. При наявності симптомів отруєння після закінчення зазначених процедур звернутися за медичною допомогою.

Попадання в очі: Ретельно промити очі великою кількістю води. При необхідності звернутися за медичною допомогою.

Проливання (просипання) матеріалу: У разі проливання або прокидання матеріалу потрібно зробити наступне:

А) при великій кількості – одягнути захисний спецодяг, рукавички, окуляри і маску; зібрати матеріал в контейнер і ретельно його закупорити; утилізація матеріалу – відповідно до чинного законодавства; видалити залишки речовини великою кількістю води;

Б) при невеликій кількості – одягнути захисні рукавички і видалити залишки речовини великою кількістю води.

БУДЬТЕ УВАЖНі ПІД ЧАС ВИКОРИСТАННЯ СУХИХ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ

Некоторые из возможных ошибок при приготовлении сред

Для отримання оптимальних результатів застосування продукти компанії HiMedia важливо зберігати при відповідних умовах. Не слід використовувати за призначенням продукти з просроченим терміном придатності. Умови зберігання та термін придатності вказані на відповідних етикетках, контейнерах і в інструкціях-вкладишах. Рекомендується використовувати продукти в порядку зростання номерів серій і партій.

Ставлення до світла

Бажано зберігати всі приготовані живильні середовища в темряві і завжди – далеко від прямих сонячних променів.

Ставлення до температури і вологості

З огляду гігроскопічності сухі поживні середовища пошкоджуються у вологій атмосфері, тому важливо не залишати ємності з ними надовго відкритими. Висока температура зберігання чи умови кімнати для приготування поживних середовищ не є придатними для зберігання контейнерів з живильними середовищами, особливо тих, які часто відкривають.

Рекомендований час і температура зберігання

Сухі поживні середовища (М)

Нерозпечатані сухі поживні середовища при зберіганні в оптимальних умовах мають термін придатності 2-5 років.

Висушені поживні середовища виробництва компанії HiMedia поставляються в непрозорих водовідштовхувальних пластикових флаконах з накручуваним ковпачком, який має внутрішню кришку, тому не потребує додаткового закупорювання. Після взяття середовища кришку треба повернути на місце і ретельно закопати нею флакон.

Нерозкриті контейнери із середовищами слід зберігати при температурі нижче 25 ° С або нижче 8 ° С, якщо немає інших вказівок (див. етикетку).

При першому розтині флакона або іншого контейнера на ньому пишуть дату розкриття.

Диски с антибиотиками (SD, OD)
Хранят при минус 20 °С, рабочие партии – при +2…8 °С. Срок хранения – от 1 до 3 лет.

Матеріали для диференціації мікробів

Рекомендується зберігати при + 2 … 8 ° С, за винятком факторів V і X (при мінус 10 ° С) і дисків з вуглеводами (нижче 30 ° С); термін зберігання – від 9 місяців до 2 років.

Створення поживних середовищ для мікроорганізмів вимагає зваженої оцінки, як окремого інгредієнта, так і взаємодії всіх компонентів один з одним. Усвідомлюючи це, фахівці компанії HiMedia застосовують відповідні методи контролю на різних етапах виробництва, що дозволяє отримувати високоякісні живильні середовища. Їх застосування забезпечує необхідну відтворюваність результатів дослідження.

Контроль якості окремих компонентів

До складу сухих поживних середовищ входять різні компоненти:

• Пептон (джерело азоту);
• Вуглеводи (джерело вуглецю);
• Мінеральні речовини (неорганічні солі, мікроелементи);
• Селективні речовини;
• Вітаміни;
• Барвники і індикатори pH;
• Гелеутворюючий компонент.

1. Пептони (м’ясний, казеїновий, соєвий, желатиновий, дріжджовий і ін.): Продукти гідролізу білка, зазвичай звані пептонами, являють собою суміш поліпептидів, олігопептидів, амінокислот, органічних джерел азоту, солей і мікроелементів. Застосування різних пептонов відображає різні потреби мікроорганізмів в амінокислотах і пептидах. Характеристики пептона залежать від джерел білка (казеїн, м’ясо або соя) і типу гідролізу: кислотного або ферментативного (трипсин, пепсин або папаин).

Для контролю вироблених пептонов, крім власного комплексу досліджень, компанія HiMedia проводить аналіз згідно Фармакопеї США (розділ “Peptic Digest of Animal Tissue”) на відповідність критерію “Панкреатичний перевар казеїну” (14).

Звичайні тести для аналізу пептонов

1. 1. Ступінь перетравлення;

   2. Втрата при 100 ° С;

   3. Вміст азоту;

   4. Вміст a -аміного азоту;

   5. Залишок після спалювання (зольність);

   6. Відсутність нітритів;

   7. Вміст солей (наприклад, NaCl);

   8. Вміст фосфатів;

   9. Мікроелементи;

   10. Ферментувальні вуглеводи;

   11. Ліпіди;

   12. Вітаміни;

   13. Сумісність з іншими інгредієнтами при 121 ° С протягом 15 хвилин;

   14. Оцінка мікробіологами: а) по виявленню специфічних метаболітів (індолу, ацетілметілкарбінола, сірководню); б) по ростовими властивостями (на рідких середовищах оцінюють ступінь каламутності, на щільних – характеристики колоній мікроорганізмів за методом Miles і Misra (12)).

3.Вугливоди.

Деякі мікроорганізми можуть утилізувати широкий спектр вуглеводів, інші більш вибагливі або утилізують лише один вуглевод.Останні можна ідентифікувати по ферментації або окислення ними вуглеводів, доданих в середовище. У діагностичній практиці бактеріології використовується велика кількість поживних середовищ, до складу яких входять специфічні вуглеводи і індикатори для виявлення особливих ферментативних реакцій (2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 13).

Вуглеводи, які використовуються в поживних середовищах, перевіряють на справжність і відсутність домішок. Контроль здійснюють у такий спосіб. Готують рідкі і щільні поживні середовища з одним відомим вуглеводом – стандартним і випробуваним. Потім перевіряють здатність вуглеводів підтримувати зростання мікроорганізмів. На щільних середовищах після посіву і інкубування порівнюють характеристики колоній на середовищі зі стандартним вуглеводом і з випробуваним (за розміром, кольором, формою і реакції індикаторів).

3. Мінеральні речовини та інші компоненти:

Деякі мінеральні солі необхідні для росту і метаболізму всіх живих клітин. Для більшості бактерій потрібна наявность в живильному середовищі натрію, калію, магнію, марганцю, дво- або тривалентного заліза у вигляді солей (хлоридів, фосфатів, сульфатів).

4. Селективні речовини (солі жовчних кислот і бичача жовч)

Речовини, що отримуються з жовчі, вводять до складу поживних середовищ для диференціації бактерій, адаптованих і неадаптованих до умов проживання в кишечнику.

Для диференціації бактерій по толерантності до жовчі готують селективні середовища з підвищеною концентрацією жовчі і її похідних.

Хімічний аналіз солей жовчі проводиться, як описано в National Formulary для дезоксихолату натрію, холату натрію і таурохолату натрію (B.P. 1949 14 – U.S.P.).

У живильному середовищі ці речовини не повинні впливати на первісний колір індикаторного забарвлення і його подальші зміни в процесі росту мікроорганізмів.

Середовище при цьому не повинне пінитися або давати осад при зберіганні. Далі проводиться функціональна перевірка жовчі, з використанням в якості контролю стандартних жовчних солей. Проводиться також тест по виділенню референс-штаму E. coli на середовищах з випробуваними і стандартними жовчними солями.

Щільні живильні середовища з різними солями жовчі перевіряються методом поверхневої краплі по Miles і Misra (12).

Для кожної середовища записуються ростові характеристики різних ентеробактерій.

5. Барвники і індикатори pH

Добавляємі в поживні середовища барвники використовують як селективні речовини, а також в якості індикаторів pH або окислювально-відновного потенціалу. Їхня інгібуюча активність може залежати від взаємодії з іншими компонентами середовища. Так, активність діамантового зеленого в відношення E. coli істотно варіюється в розчинах різних пептонов. З діамантовим зеленим взаємодіють солі жовчі, в результаті чого знижується токсичність фарби і це треба враховувати при введенні таких барвників в середовище з жовчними солями. Анілінові барвники більш токсичні в стані повного окислення, а при їх стерилізації в присутності пептона (в складі бульйону) можливо їх часткове відновлення. Також при використанні агару з високим вмістом мінеральних речовин часто спостерігається несумісність компонентів середовища. У зв’язку з цим необхідно, щоб барвники, що використовуються для приготування поживних середовищ, проходили контроль згідно “H.J.Conn’s Biological Stains”, 9е видання, видавництво Williams & Wilkins Company, Baltimore. Крім контролю хімічної чистоти барвник повинен бути перевірений мікробіологічним методом, тобто шляхом посіву референс-штамів на середовища з випробуваним і стандартним барвниками, інкубування і порівняння результатів посіву.

6. Гелеутворювач.

Основне призначення агар-агару в живильному середовищі – сформувати гель певної щільності. Важливою характеристикою є також прозорість агарового живильного середовища. В ідеалі, розплавлений агар повинен бути кришталево чистим, без ознак помутніння або осаду. Причиною помутніння є несумісність мінеральних речовин або попадання в середовище найдрібніших частинок (в результаті неефективної фільтрації). Іншою характеристикою агару є параметри дифузії різних хімічних сполук в агаровому гелі. Ця властивість агарових середовищ використовується для мікробіологічної оцінки вітамінів і антибіотиків. Дифузія відбувається з резервуара, розташованого в певній точці агару. При цьому навколо резервуара утворюється зона затримки росту мікробів, діаметр якої прямо пропорційний активності антибіотика або зона зростання, пропорційна активності вітаміну.

Агар-агар для бактеріологічних цілей повинен відповідати наступним хімічним параметрам:

Крім того, проводиться тест на присутність в агарі токсичних речовин та інгібіторів росту мікроорганізмів. Для цього на випробуване живильне середовище і середовище зі стандартним агар-агаром засівають швидко зростаючі мікроби з подальшим порівнянням швидкості росту, розміру, форми, пігментованості колоній і т. д.

7. Вітаміни

Аналіз вітамінів та їх попередників на хімічну чистоту і по іншим тестам проводиться згідно Фармакопеї США (14) і Харчовому Хімічному Кодексу США (7).

Крім хімічного аналізу активність підтверджується мікробіологічними методами по A.O.A.C. (3).

Контроль якості в ході виробництва:

Зразки готують з перевірених і затверджених компонентів і аналізують паралельно з попередньо наміченої еталонної партії готового середовища.

Велика серія партій затверджується для виробництва після оцінки всіх характеристик, включаючи колір, прозорість, рН, розчинність, гелеутворення сумісність інгредієнтів і культуральні характеристики зразка. В процесі виробництва відповідно принципами GMP (доброї практики виробництва) кожної стадії приділяється найпильніша увага (14).

На проміжних стадіях виробництва відбирають зразки і доставляють в контрольну лабораторію для мікробіологічної оцінки за власними критеріями, розробленими компанією HiMedia. При більшості виробничих процесів постійно контролюють такі умови, як температура, вологість і ін. Виробництво здійснюють на обладнанні з нержавіючої сталі або скла, що дозволяє запобігати забрудненню продукції токсичними металами.

Остаточно готову продукцію перевіряють в сухому вигляді по ряду фізичних параметрів, щоб забезпечити однорідність середовища: зовнішній вигляд, колір, запах, вологість, розчинність, прозорість, рН, температура гелеутворення (для агарових середовищ). Щоб уникнути нестабільності характеристик від партії до партії у отриманих середовищах в порівнянні з готовою до використання еталонного середовища вивчають культуральні властивості. Середовище повинне пройти всі тести, намічені лабораторією контролю якості HiMedia: ростові властивості, диференціація, біохімічні параметри, виявлення зростання при посіві мінімального інокулюму, селективність і ін. Після проходження цих тестів, продукція направляється в торгову мережу.

Дослідження стабільності при складському зберіганні кінцевої продукції:

Правила техніки безпеки

Звернення і використання

Зберігання:

1. American Public Health Association – Standard Methods for Examination of Dairy Products, 14th edition, 1978
2. American Public Health Association – Compendium of Methods for Microbiological Examination of Food, 1976
3. Association of Official Analytical Chemists, 14th edition, 1984
4. Clinical Bacteriology by E. Joan Stokes & G.L. Ridgway, 5th edition, 1980
5. Cruickshank R., Duguid, J.P., Marmion , B.P. & Swain, R.H.A., 1975, Medical Microbiology, 12th Edition, – Churchill Livingstone, Edinburg, London, New York.
6. FDA Bacteriological Analytical Manual, U.S.A., 5th edition, 1979.
7. Food Chemical Codex, 3rd edition, 1981.
8. Laboratory Procedures in Clinical Microbiology, 2nd edition, 1985 by John A. Washington Published by Springer-Verlag, New York.
9. Manual of Clinical Microbiology, 4th edition by American Society for Microbiology, Washington D.C., 1985.
10. Media for isolation-cultivation-identification & Maintenance of Medical Bacteria. Vol. I, by Jean F.MacFaddin, Williams & Wilkins. Baltimore, 1985.
11. Methods in Carbohydrate Chemistry Vol I, Academic Press, U.S.A.
12. Miles A.A. & Misra S.S. (1938) “The Examination of Bactericidal Power of Blood” J. Hyg. Camb 38, 732-748
13. Standard Methods for Examination of Water and Wastewater 1985, 16th edition, APHA, AWWA, WPCF.
14. U.S. Pharmacopeia XXI National Formulary XVI, 1985.